Genomo redagavimas – viena sparčiausiai besivystančių šiuolaikinės biotechnologijos sričių. Jo galimybės jau keičia mediciną, žemės ūkį ir net leidžia atkurti išnykusias gyvūnų rūšis. Tačiau efektyviam ir saugiam genomo redagavimui būtina kruopščiai patikrinti naudojamas „genų žirkles“.
Vilniaus universiteto (VU) mokslininkų sukurtas inovatyvus „CROFT-Seq“ metodas leidžia dar mėgintuvėlyje preciziškai įvertinti CRISPR/Cas9 genomo redagavimo įrankių efektyvumą ir tikslumą bei gerokai sumažinti mokslinių tyrimų kaštus.
Apie patentuojamą metodą pasakoja vienas iš jo autorių VU Gyvybės mokslų centro Biotechnologijos Instituto Baltymų-nukleorūgščių sąveikos tyrimų skyriaus vyriausiasis mokslo darbuotojas dr. Mindaugas Zaremba.
Metodas leidžia atrinkti tiksliausias „genų žirkles“
Dr. M. Zaremba pasakoja, kad „CROFT-Seq“ (angl. CRISPR nuclease off-target detection by sequencing) metodas yra skirtas labiausiai paplitusių genomo redagavimo įrankių, tokių kaip CRISPR/Cas9 nukleazių, efektyvumo ir tikslumo nustatymui.
„Tai reiškia, kad CRISPR/Cas9 nukleazės, arba kitaip vadinamos „genų žirklės“, gali būti sukomponuotos labai įvairiai, siekiant, kad kirptų konkrečią genomo vietą. Vykdant genomo redagavimo eksperimentus gyvose ląstelėse (in vivo), kurie yra labai brangūs, yra naudinga dar mėgintuvėlyje (in vitro) ištirti atrinktas „genų žirkles“ ir išsiaiškinti, kaip efektyviai jos kerpa ten, kur turi kirpti ir ar nekerpa ten, kur neturėtų kirpti“, – pasakoja mokslininkas.
Šis metodas leidžia atrinkti efektyviausius ir tiksliausius „genų žirklių“ variantus ir toliau bandymus atlikti tik su jais, taip sumažinant tolimesnių mokslinių tyrimų kaštus. Mokslininkai pirmiausia nustato „genų žirklių“ kirpimo potencialą ir tikslumą mėgintuvėlyje, o vėliau pereina prie kitų stadijų.
„Tikslumas čia yra itin svarbus, nes siekiant išgydyti tam tikrą genetinę ligą, visame žmogaus genome reikia tiksliai perkirpti kurį vieną ar kelis konkrečius genus tam tikrose jų vietose, kad įvyktų sėkmingas ligą sukeliančių genų mutacijų ištaisymas (redagavimas). Šias „genų žirkles“ panaudojus netiksliai, jos gali įvesti dvigrandžius DNR trūkius (perkirpti) kitose genomo vietose ir taip sąlygoti ląstelių žūtį ar net vėžio atsiradimą. Tad mūsų metodas leidžia to išvengti, greitai ir ekonomiškai patikrinant genų žirklių efektyvumą ir tikslumą dar mėgintuvėlyje“, – metodą pristato tyrėjas.
Naujas metodas sumažina mokslinių tyrimų kaštus
Dr. M. Zaremba pasakoja, kad šiandien rinkoje yra sukurta nemažai panašią funkciją atliekančių metodų, bet dėl pasirinktos originalios strategijos ir unikalių sprendimų mokslininkai sugebėjo šį metodą gerokai pagreitinti, o kainą sumažinti iki 10-ies kartų.
„CROFT-Seq“ metodas leidžia sumažinti mokslinių tyrimų kainą, bet atlikti šiuos tyrimus itin tiksliai. Būtent dėl to jis yra patrauklus tiek verslo įmonėms, tiek mokslinių tyrimų centrams“, – teigia tyrėjas.
Nemažiau svarbu ir tai, kad pavykus supaprastinti metodą, jis tapo tinkamas automatizavimui panaudojant didelio našumo robotines skysčių sistemas.
„Mes taip supaprastinome metodą, kad praktiškai visos jo stadijos gali būti atliekamos viename mėgintuvėlyje. Galimybė pasitelkti robotines skysčių sistemas leidžia ne tik taupyti laiką, bet ir sumažinti klaidų riziką“, – pažymi mokslininkas.
Renkantis kurį metodą naudoti, labai svarbi ir gautų duomenų analizė. Nemažai šios srities metodų sekoskaitos duomenų analizei naudoja tam tikrus bioinformatikinius filtrus, kurie apriboja gautų rezultatų interpretavimą.
„Mūsų metode filtrų naudojimas yra minimizuotas. Todėl jeigu „genų žirklės“ DNR kerpa ne tik savo taikinyje (angl. on-target), bet kur nors kitur, dar vadinamame „off-target“, tai mūsų metodas tokius netikslius kirpimus nustato. Tuo metu kitų metodų naudojami filtrai gali realiai esantį netikslų taikinį netinkamai išfiltruoti ir iškraipyti galutinius rezultatus“, – privalumus dėsto dr. M. Zaremba.
Turime pasistengti, kad pasivytume JAV
Šiuo metu dr. M. Zaremba su kolegoms vykdo VU mokslo skatinimo fondo projektą „Platforma įvairių genomo redagavimo įrankių tikslumo įvertinimui“.
Mokslininkai siekia, kad „CROFT-Seq“ būtų taikomas ir kitiems vis labiau populiarėjantiems genomo redagavimo įrankiams, tokiems kaip CRISPR/Cas12 ar TnpB fermentams, bazių redaktoriams (angl. base editors).
„Siekiame padidinti mūsų metodo lankstumą ir patrauklumą, atveriant galimybę tirti kitus genomų redagavimo įrankius. Patį metodą sukūrėme vykdydami Centrinės projektų valdymų agentūros kompetencijų centrų projektą „Dvigrandžių DNR trūkių sekoskaitos centras“, – sako tyrėjas.
Projekto metu sukurtą metodą mokslininkai nusprendė patentuoti ir pateikė paraiškas, skirtas apsaugoti jį Europos, JAV ir Japonijos rinkose.
„Šios rinkos genomo redagavimo srities moksliniuose tyrimuose yra daugiausiai pažengusios, o JAV – ir šių tyrimų rezultatų taikyme. JAV yra paprastesni reguliaciniai mechanizmai nei Europos Sąjungoje (ES), dėl to ES stipriai atsilieka. Tad šiose lenktynėse mes nusileidžiame JAV ir prarandame labai dideles CRISPR/Cas technologijos taikymo galimybes tiek augalininkystėje bei gyvulininkystėje, tiek ir žmonių gydyme“, – pažymi mokslininkas.
2023 m. buvo patvirtintas pirmasis CRISPR/Cas9 technologija paremtas vaistas, skirtas pjautuvinei anemijai gydyti. Tai leido išgydyti šią monogenetinę ligą ir tapo tikru proveržiu. Šiuo metu vykdoma labai daug ikiklinikinių tyrimų siekiant šią technologiją pritaikyti ir kitų ligų gydymui.
„Daugybė genetinių ligų nėra monogenetinės. Tai reiškia, kad jų atsiradimą lemia mutacijos ne viename, o keliuose genuose, todėl iškyla gerokai daugiau iššūkių siekiant jas išgydyti. Tikiu, kad laikui bėgant CRISPR/Cas technologija padarys didelę pažangą ir šių ligų gydyme“, – sako dr. M. Zaremba.
Kitas genomo redagavimo taikymo pavyzdys – išnykusių gyvūnų rūšių atkūrimas, kurį jau vykdo privačios kompanijos JAV. „Tai tik dar kartą įrodo technologijos potencialą. Žinoma, gali kilti nemažai technologijos saugumo bei etinių iššūkių, bet, tikiuosi, kad pavyks juos išspręsti“, – viliasi mokslininkas.
